MODELLO PRIN 2005


1.	Area Scientifico Disciplinare	02: Scienze fisiche	100%

Unità	Responsabile Scientifico	Qualifica	Settore Disc.	Università	Dipart./Istituto	Mesi Uomo
I	LEONE MAURIZIO	Professore Ordinario	FIS/07	Università degli Studi di PALERMO	Dip. SCIENZE FISICHE ED ASTRONOMICHE	16
II	MORANTE SILVIA	Professore Associato	FIS/07	Università degli Studi di ROMA "Tor Vergata"	Dip. FISICA	22
III	SPORTELLI LUIGI	Professore Ordinario	FIS/07	Università della CALABRIA	Dip. FISICA	10

Lo scopo del progetto è quello di studiare gli effetti della presenza di ioni metallici in soluzione sui processi di aggregazione di proteine. La rilevanza di questo studio è duplice: da una parte vi è un forte interesse biomedico, legato alla comprensione dei meccanismi che stanno alla base dei processi di aggregazione amiloide, che sono fortemente influenzati, sia in vivo che in vitro, dalla presenza di ioni metallici; vi è inoltre un interesse di ricerca di base, legato alla comprensione dei meccanismi di interazione proteina-proteina mediata dal solvente.

Come riportato nella sezione relativa alla Base Scientifica del progetto, i processi di aggregazione si possano pensare come il risultato di differenti meccanismi su differenti scale gerarchiche, strettamente interconnessi tra di loro. Rimangono tuttavia molte domande ancora aperte, poiché la totalità di questi meccanismi, la loro gerarchia e le loro interconnessioni sono ancora ben lontane dall’essere chiari.

Alcune evidenze sperimentali riportate in letteratura sembrano indicare che il processo guida verso l’aggregazione sia dato da cambiamenti conformazionali che, partendo dalla conformazione nativa, portano la proteina verso strutture parzialmente unfolded. Questo, ad esempio, potrebbe provocare la parziale esposizione al solvente di gruppi apolari che nella conformazione nativa sono contenuti all’interno della matrice proteica, e darebbe luogo a nuove interazioni proteina-proteina non presenti quando le singole molecole proteiche assumono la struttura nativa. Inoltre, la formazione di stati aggregati potrebbe a sua volta rafforzare questo processo, favorendo una esposizione sempre maggiore dei gruppi idrofobici per via delle modificate condizioni nell’immediato intorno delle singole molecole proteiche. Si creerebbe in tal modo un meccanismo di feedback capace di innescare un processo di self-trapping in minimi sempre più profondi dell’energia libera dell’intero sistema proteine-solvente.

In questo scenario, è necessario chiedersi perché in condizioni fisiologiche la singola proteina evolve improvvisamente verso una condizione di non-equilibrio, invece di permanere nel suo stato nativo. L’ipotesi di fluttuazioni anomale, il cui tempo di vita sia sufficiente per innescare il meccanismo di self-trapping sopra riportato, anche se non appare del tutto giustificata, va tenuta in considerazione. Sembra comunque più ragionevole il supporre che variazioni nelle condizioni ambientali possano indurre l’insorgere di cambiamenti conformazionali delle singole molecole proteiche. Diversi studi in vitro supportano questa visione, dimostrando che cambiamenti di pH, temperatura, forza ionica ecc. ecc. sono in grado di indurre cambiamenti conformazionali e di innescare processi di aggregazione.

Alternativamente, si può ipotizzare che variazioni nelle condizioni esterne perturbino l’equilibrio proteina singola vs. aggregati indipendentemente da variazioni della struttura nativa, dando così luogo alla formazione di aggregati. In questo contesto, i cambiamenti conformazionali avverrebbero successivamente alla formazione degli aggregati, per via delle mutate condizioni dell’intorno. In questo tipo di processi, il cui prototipo è la formazione delle strutture quaternarie (vedi emoglobina), i cambiamenti conformazionali non costituiscono più il processo guida; piuttosto, il loro ruolo si riduce a quello di progressivi aggiustamenti che minimizzano l’energia.

Le considerazioni fatte sopra sono particolarmente rilevanti nel caso dei processi di aggregazione in presenza di ioni metallici. Scopo del progetto è quello di raccogliere in maniera sistematica dati sperimentali che siano in grado di fornire ulteriori informazioni sui meccanismi sopra descritti. L’approccio sperimentale consisterà nello studio dei processi e delle cinetiche di aggregazione in presenza di ioni metallici per alcune opportune proteine: la beta-lactoglobulina (BLG), il lisozima e il peptide beta-amiloide (bA). La BLG e il lisozima sono ottimi sistemi modello e la loro capacità subire processi di aggregazione nettamente distinti (aggregati amorfi oppure fibrille amiloidi) al variare delle condizioni esterne sarà utilizzata per studiare gli effetti degli ioni metallici sui diversi tipi di aggregazione. Il peptide bA presenta invece un notevole interesse intrinseco per via del suo coinvolgimento nel Morbo di Alzheimer e per il ruolo giocato in questo contesto dagli ioni metallici (vedi Base Scientifica e/o Programma).

Le tecniche utilizzate e le expertises delle tre unità di ricerca coinvolte permetteranno di separare, anche temporalmente, i processi a livello di singole molecole (cambiamenti conformazionali e strutturali) da quelli di aggregazione sopramolecolare fino alla formazione di aggregati amorfi o fibrille. Sarà inoltre possibile, grazie alla varietà delle tecniche sperimentali utilizzate, caratterizzare separatamente gli ioni metallici e le proteine.

Uno degli scopi del progetto è quello di quantificare sistematicamente l’effetto degli ioni metallici sui processi di aggregazione. L’approccio parallelo con le diverse tecniche sperimentali può infatti consentire di appianare alcune delle contraddizioni presenti in letteratura. Si cercherà quindi di verificare se la presenza di ioni metallo agisca direttamente sui cambiamenti conformazionale delle singole proteine, innescando in tal modo i processi di aggregazione, oppure se favorisca l’insorgere di interazioni proteina-proteina, dando luogo a fluttuazioni di concentrazione che possano parallelamente innescare i cambiamenti conformazionali e rinforzare il meccanismo di aggregazione.

Aim of this project is to study the effect on protein aggregation process of the presence of metal ions in solution. This kind of studies has a twofold relevance due to its biomedical interest concerning the comprehension of mechanisms at the basis of amyloidal, aggregation that are strongly influenced both in vivo or in vitro by metal ions, and due to the great interest also from a fundamental research point of view, related to the understanding of solvent modulated protein-protein interaction mechanisms.

Aggregation processes, as reported in “Project Background“ section, can be seen as the result of different mechanisms, with different hierarchies, acting on different scales of time and space, and closely interconnected to each other. Nevertheless, many questions are still open since the global view of these mechanisms, their hierarchies and their detailed interconnection are far to be clarified.

Several experimental evidences reported in literature seem to indicate that conformational changes represent the driving-process towards the aggregation, by leading protein from native conformation to partially unfolded structures. As an example, these changes could yield to partial exposure of non-polar groups buried inside protein’s structure in native conformation, giving rise to new intermolecular interactions that are absent when single proteins are in their native state. Moreover, aggregates formation could in turn enhance this process, leading to greater exposure of hydrophobic groups because of modified conditions in the surroundings of single protein molecules. In such a way, it would be created a feedback mechanism able to induce self-trapping processes in deeper free energy minima of the entire protein-solvent system.

In this scenario, it is straightforward to ask why in physiological conditions the single protein molecules suddenly evolve towards a non equilibrium state instead of remain in its native state. Even if not completely justified, the hypothesis of anomalous fluctuations with long enough life-time to induce the above mentioned self trapping mechanism, must be take into account. However, it seems more reasonable that changes in the environmen can induce conformational changes in protein molecules. A great number of in vitro studies supports this last point of view, demonstrating that variation of pH, temperature, ionic strength etc. are able to induce conformational changes and consequently lead to aggregation processes.

Alternatively, it can be assumed that variations in the external conditions could perturb the equilibrium single protein vs. aggregated structures, independently from native structure changes, and therefore giving rise to aggregate formation. In this context, conformational changes would occur afterwards aggregates formation, because of changes in surroundings conditions.

In this kind of processes, whose prototype is the formation of quaternary structures (see for example hemoglobin), conformational changes do not constitute the driving process; rather, their role is reduced to progressive adjustments lowering the free-energy.

These considerations become particularly important and interesting when protein aggregation occurs in the presence of metal ions.
Aim of the project is to collect in a systematic way experimental data able to give new insight on the above reported mechanisms. The experimental approach will consist in studying the aggregation processes and the kinetics of some selected proteins in presence of metal ions.

These proteins are the beta-lactoglobulin (BLG), lysozyme and the beta-amyloid peptide (bA).

BLG and Lysozyme are very good model systems and their ability to undergo clearly distinguished aggregation processes (amorphous aggregates or amyloid fibrils) by varying external conditions will be used to study the metal ion effects on different kind of aggregation. Instead, bA peptide presents a remarkable intrinsic interest because of its involvement in Alzheimer disease and because of the role metal ions play in this context (see background or Program).

The optical techniques and the expertises of the three involved Research Units will allow separating, also in time scales, the processes at single protein level (conformational and structural changes) from those relative to sopramolecular aggregation up to the formation of amorphous aggregates or fibrils. Moreover, it will be possible, by using a variety of experimental techniques, to separately characterize metal ions and proteins.

One of the aims of the project is to systematically quantify the metal ions effects the evolution of the aggregation processes. The parallel approach with different experimental techniques can concur to resolve some contradiction present in literature. Therefore it will be attempted to verify if the metal ions presence would directly act on single proteins conformational changes, inducing in such a way the aggregation processes, or if their presence would favour protein-protein interactions, giving rise to fluctuations of concentration that could yield conformational changes and reinforce the aggregation mechanisms.

I processi di aggregazione delle proteine sono stati oggetto di numerosi studi in vista della loro rilevanza in molti campi della ricerca scientifica e tecnologica, dalla medicina alle scienze alimentari. Grazie alle ricerche fin qui portate a compimento, è ormai largamente diffusa l’idea che questi processi coinvolgono differenti meccanismi come ad esempio cambiamenti conformazionali e strutturali delle singole molecole proteiche, processi di nucleazione, interazioni proteina-proteina e conseguente formazione di legami intermolecolari. Tali meccanismi che avvengono su differenti scale spazio-temporali possono evolversi in più fasi ed essere interconnessi. [M.Manno et al. 2004 ;P.L. San Biagio et al 1999, V. Militello et al. 2003].

Dal punto di vista della singola molecola proteica, l’eterogeneità conformazionale e la capacità di esplorare un gran numero di minimi di energia libera (sottostati conformazionali) costituiscono la chiave per la comprensione della sorprendente versatilità delle proteine coinvolte in una vasta gamma di differenti attività funzionali. Insieme ad uno specifico arrangiamento strutturale, le proteine mostrano una grande varietà di moti, come fluttuazioni locali di singoli atomi o riarrangiamenti strutturali di ampio respiro, che avvengono su scale di tempi molto diverse, dai picosecondi ai minuti, o anche ai giorni. La dinamica delle proteine risulta dominata da moti di tipo armonico a bassa temperatura (all’incirca sotto i 180 K) e da contributi non armonici all’aumentare della temperatura. Tali contributi non armonici, che nascono dalle fluttuazioni termiche di ogni molecola proteica attraverso i sottostati conformazionali, sembrano essere un prerequisito per le specifiche attività funzionali. In questo scenario, non và trascurato il ruolo giocato dalle interazioni con la matrice esterna sulla stabilità, sulla dinamica e sulla funzione delle proteine.

I processi di interazione proteina-proteina sono strettamente connessi con quanto sopra riportato in quanto implicano in genere cambiamenti conformazionali dell’intera proteina o di domini specifici, dando luogo ad associazioni di molecole parzialmente “unfolded” [D. Foguel et al. 2003, V.Militello et al. 2003, Hamada et al. 2002]. Cambiamenti anche piccoli nelle configurazioni locali possono dar luogo a grandi riarrangiamenti delle macromolecole che possono portare all’esposizione al solvente di residui apolari. Da questo punto di vista, la proteina nativa e gli aggregati si possono considerare come derivanti da un insieme di molecole parzialmente “unfolded” fluttuanti tra diversi sottostati conformazionali che, a causa delle interazioni con il solvente e con le molecole vicine, seguono percorsi alternativi. Di fatto, al giorno d’oggi l’aggregazione viene considerata come un processo che agisce in competizione al normale processo di folding delle proteine e sembra essere una caratteristica generale di ogni catena polipeptidica [D.R. Booth et al. 1997, Taddei et al. 2001, Chiti et al. 2002]

Sotto opportune condizioni destabilizzanti tutte le proteine sono probabilmente capaci di subire un “mis-folding” e successivamente di auto assemblarsi in aggregati ordinati noti come fibrille amiloidi [Fandrich 2002, Arai et al. 1999]. Il termine amiloidosi indica una famiglia di patologie causate dalla transizione di proteine endogene e peptici da uno stato globulare fisiologico ad uno fibrillare patologico. Nonostante la diversità delle conformazioni e delle dimensioni delle proteine di origine, tutte le fibrille amiloidi presentano una notevole somiglianza: esse sono formate da protofilamenti intrecciati in modo elicoidale, a loro volta composti da beta sheets disposti perpendicolarmente alla direzione di elongazione e stabilizzati da un gran numero di legami idrogeno [Ionescu-Zanetti et al., 1999; Khurana et al., 2003]. La formazione di fibrille amiloidi risulta essere un evento chiave in diverse patologie (amiloidosi), tra cui il morbo di Parkinson, il morbo di Alzheimer e il morbo di Creutzfeldt-Jacob. Tutte queste patologie sono caratterizzate dalla abnorme deposizione extracellulare di fibrille amiloidi [Kelly et al., 1998; Uversky et al., 2001; Foguel et al., 2004]. È da notare che anche proteine globulari estranee a qualunque patologia e con nessuna analogia con le proteine implicate in patologie amiloidi possono formare fibrille simili a quelle estratte dai tessuti colpiti da malattia [Arai ,1999].

E’ stato osservato che le placche senili tipiche del morbo di Alzheimer contengono una gran quantità di ioni metallo come Cu+2, Fe+3 e Zn+2 (essendo quest’ultimo il più abbondante). Il loro ruolo non è ancora ben chiaro ma, ad esempio, la formazione di fibrille amiloidi da parte del peptide beta amiloide (bA), cioè il principale componente delle placche, risulta sensibilmente accelerata dalla presenza di ioni rame e zinco [Bush et al., 1994; Mantyh et al., 1993]. È quindi sufficientemente chiaro che questi ioni potrebbero avere conseguenze significative sui processi di unfolding e/o di aggregazione.

Gli ioni metallici possono anche alterare su scala macroscopica la tipologia degli aggregati ottenuti. Ad esempio, la presenza di ioni di ferro è in grado di indurre processi di gelazione “a freddo” negli aggregati di beta-lactoglobulina (BLG), uno dei maggiori costituenti del latte bovino [Remondetto et al., 2003].

Protein aggregation processes have been the subject of several studies in sight of their relevance in many fields of the scientific and technological research from medicine to alimentary sciences. Thanks to these recent researches it is widely diffused the idea that these kind of processes involves several mechanisms as, for example, conformational and structural changes at single protein level, nucleation processes and protein-protein interactions with the consequent formation of new intermolecular bonds. These mechanisms acting in different scales of time and space may evolve in different phases and be interconnected. [M.Manno et al. 2004 ; P.L. San Biagio et al. 1999, Militello et al. 2003].

The conformational heterogeneity of the single protein, and the ability to fluctuate through a large number of free energy minima (conformational substates) constitute the key to understand the astonishingly versatility of proteins involved in different functional activities. Together with a specific structural arrangement, they exhibit a large variety of motions, like local fluctuations of single atoms or structural rearrangements of wide extent, ranging in a large variety of time scales, from picoseconds to minutes and even days. Proteins dynamics is dominated by harmonic motions at low temperature (about above 180K) and additional non harmonic contributions as the temperature increases. These non-harmonic motions, arising from thermal fluctuations of a protein molecule among conformational substates appear to be a prerequisite for specific functional activity. In this scenario, the involvement of the external matrix in protein stability, dynamics and function must be also considered.

Protein-protein interactions are strictly related to what it was said above, since usually involve conformational changes of the whole protein or of a specific domain and it is often attributed to the association of partially unfolded molecules [D. Foguel et al. 2003, V.Militello et al. 2003, Hamada et al. 2002]. In fact, small changes in local configuration could allow a great stereo-reorganization of macromolecules. In this respect, the native protein and its aggregates can be seen as originating from a common population of partially unfolded, interconverting molecules that, due to interactions with the solvent and with the neighbour molecules, proceed towards different pathways. The aggregation process is today considered as process acting in competition with the normal folding pathway and appear to be common property of any polypeptide chain [D.R. Booth et al. 1997, Taddei et al. 2001, Chiti et al. 2002]

Under specific destabilizing condition all proteins seem to have the ability to ”misfold” and subsequently assemble themselves in ordered sovramolecular aggregates known as Amyloid fibrils [M. Fandrich 2002, S. Arai et al. 1999]. The word Amiloydosis indicates a pathologies family due to endogen proteins and peptides transition from a physiologic globular state to a fibrillar and pathologic one. In spite of the variety and dimensions of initial proteins, all amyloid fibrils present a close resemblance to each other: these structure are formed by protofilaments intertwined in helical shape; these protofilaments are composed from beta sheets perpendicular to the long axis direction of the fibril and stabilized from a great number of hydrogen bonds [Ionescu-Zanetti et al., 1999; Khurana et al., 2003]. Amyloid fibril formation appear to be a fundamental event in the etiology of different pathologies (amyloidos) such as Parkinson’s and Alzheimer disease and Creutzfeldt-Jacob disease. All these pathologies are related to abnormous extracellular deposition of amyloid fibrils [Kelly et al., 1998; Uversky et al., 2001; Foguel et al., 2004]. It is important to note that also globular proteins with no homology to each other or to the disease-associated proteins have the ability to form fibrils that resemble those extracted from diseased tissue [Arai et al. 1999].

It has been observed that senile plaques typical of Alzheimer disease plaques contain high quantities of metal ions such Cu+2, Fe+3 e Zn+2 (this last being the most abundant). The role of these ions is still unclear but several evidences indicate their implication in this kind of processes for example, the fibril formation originating by beta amyloid peptide bA, i.e. the main component of the plaques, result to be sizeably accelerated by zinc and copper ions presence [Bush et al., 1994; Mantyh et al., 1993]. For this reason it appears clear that these ions could have significant consequences on unfolding and/or of aggregation processes.

Moreover, metal ions could be able to change aggregate structure typology in macroscopic scale. For instance, the Iron ions presence induce “cold gelation” processes in aggregate structures rising from beta lactoglobulin (BLG) that is one of the major constituent of whey of ruminant milk. [Remondetto et al., 2003].

I meccanismi attraverso i quali gli ioni metallici influenzano i processi di aggregazione delle proteine rimangono ancora in larga parte oscuri. Scopo del progetto è quello di studiare tali meccanismi attraverso l’utilizzo di una vasta gamma di tecniche sperimentali che consentano di ottenere informazioni 1) sulle strutture locali che possono formarsi attorno agli ioni metallici durante il processo di aggregazione e 2) sui cambiamenti conformazionali delle proteine e la loro aggregazione in presenza di ioni metallici. I processi di aggregazione saranno studiati quindi “guardando” sia al metallo sia alle proteine. Si spera in tal modo di evidenziare l’effetto degli ioni metallici nelle differenti fasi del processo di aggregazione, ossia 1) sui cambiamenti conformazionali che portano la proteina in una struttura parzialmente “unfolded” e 2) sulla conseguente aggregazione.

La flessibilità di questo progetto potrà permetterci di superare le difficoltà relative all’attuale ignoranza sulla natura delle interazioni che sono probabilmente responsabili dell'instaurarsi delle patologie neuro-degenerative.

Le proteine che attualmente sembrano le più indicate per questo tipo di studio, sono la beta-lactoglobulina (BLG), il lisozima ed il peptide beta-amiloide (bA).

La BLG ed il lisozima sono “piccole” proteine globulari utilizzate spesso come sistemi modello nello studio di fenomeni complessi. Sono proteine commercialmente reperibili e ampiamente studiate, le cui caratteristiche strutturali sono ben note. Entrambe queste proteine, pur essendo strutturalmente molto stabili, sotto opportune condizioni esterne possono subire cambiamenti conformazionali al livello delle strutture terziaria e secondaria, col conseguente innestarsi di processi di aggregazione.

La BLG è uno dei maggiori costituenti del latte bovino. Il suo stato di associazione dipende dal pH, per cui ad esempio la proteina si presenta dimerica a pH neutro e monomerica a pH acido. Il monomero è composto da 162 aminoacidi e la sua struttura secondaria è costituita per la maggior parte da strutture beta (nove beta-strands antiparalleli e due corte eliche alfa). Nella proteina sono presenti due triptofani, il primo dei quali (trp61) si trova in una zona esterna completamente esposto al solvente mentre il secondo (trp19) è al centro di una cavità idrofobica nel “core” della proteina. La BLG possiede inoltre 5 cisteine, di cui 4 impegnate nella formazione di ponti di zolfo intramolecolari, particolarmente importanti per via dell’influenza che i processi di “disulfide exchange” possono avere sulla formazione di aggregati sopramolecolari. È noto che la BLG può subire processi di aggregazione e/o gelazione, che sono stati a lungo studiati sia per l’importanza che essi assumono nelle applicazioni dell’industria agro-alimentare sia perché in particolari condizioni è stata osservata la formazione di fibrille amiloidi.

Il lisozima è un piccolo enzima (129 aminoacidi) che attacca la parete cellulare dei batteri e rompe le catene di carboidrati che essi formano distruggendone così l'integrità strutturale. La sua struttura secondaria è composta da eliche alfa (45%), beta-sheets (19%) e beta-turns (23%). Sono presenti 4 ponti S-S e nessuna cisteina libera. Nella struttura del lisozima sono presenti sei triptofani allocati in differenti zone.
La tipologia degli aggregati di BLG e di lisozima dipende fortemente dalle condizioni sperimentali. In particolare, tali proteine al variare delle condizioni esterne possono formare aggregati amorfi oppure fibrille amiloidi [D.Hamada and C.M. Dobson, 2002, D.R. Booth, 1997, Shigeki Arai 1999], e pertanto si prestano bene per lo studio degli effetti degli ioni metallici su processi di aggregazione di vario tipo. Nel caso della BLG inoltre l'influenza degli ioni metallici sul processo di aggregazione è già parzialmente documentata [K. Suzuki et al. 2001, G. E. Remondetto et al. 2003].

Il peptide bA è un polipeptide composto da 39 43 residui, derivante dalla proteolisi della “Amyloid Precursor Protein” (APP). In forma solubile è un normale prodotto metabolico ed è presente nel fluido cerebrospinale e nel siero. Sembra ormai accertato che la formazione di fibrille amiloidi derivanti da questo peptide abbia un ruolo cruciale nel morbo di Alzheimer. In vitro, il processo di fibrillazione sembra essere fortemente influenzato dalla presenza di ioni metallici [Bush et al., 1994]. Inoltre, grandi concentrazioni di ioni metallici sono state riscontrate nelle placche senili tipiche del morbo di Alzheimer. In questo contesto, lo studio dei processi di aggregazione del peptide bA in presenza di ioni metallici presenta un notevole interesse intrinseco.

Per quanto riguarda la strategia generale del progetto, poichè in letteratura vengono riportati risultati contraddittori per sistemi metallo-peptide simili, sarà posta la massima attenzione nel protocollo di preparazione dei campioni e le misure sperimentali saranno portate avanti in stretta sinergia tra le tre Unità di Ricerca coinvolte. A questo scopo sarà necessaria una efficiente coordinazione con le tre unità partecipanti al progetto per lavorare su "campioni paralleli" in modo che gli stessi campioni siano sottoposti a misure diverse.

In particolare:
- Verranno raccolti dati sperimentali con differenti tecniche sperimentali (vedi quanto sotto riportato) su campioni preparati con lo stesso protocollo sperimentale o che differiscano solo per fattori di diluizione.

- Sfruttando la recentemente acquisita capacità di sintesi di peptidi in situ (Trento), piccole porzioni dei peptidi amiloidi e loro varianti potranno essere sintetizzate. In questo modo potremo studiare peptidi differenti in presenza di metalli differenti (per esempio peptidi amiloidi in presenza di Zn(II) o Cu(II) e PrP in presenza di Mn (II) o Cu(II) o altri metalli).

Per quanto riguarda le differenti tecniche utilizzate, lo studio sugli effetti degli ioni metallo sui processi di aggregazione di BLG, lisozima e peptide bA e sui cambiamenti conformazionali delle proteine che accompagnano le cinetiche di aggregazione saranno studiati tramite: spettroscopia di assorbimento nell’infrarosso (IR), nel visibile e nell’ultravioletto (UV); spettroscopia di fluorescenza statica; Dicroismo Circolare (CD). Scattering statico e dinamico di fotoni; microscopia a forza atomica (AFM). Queste tecniche permettono di analizzare il processo di aggregazione su differenti scale spazio temporali e di esplorare un vasto intervallo di concentrazioni [Manno et al., 2004; San Biagio et al., 1999; Militello et al., 2003, 2004; Vetri et al., 2005].

L'approccio sperimentale consisterà nello studio delle cinetiche degli spettri di fluorescenza sia dei cromofori intrinseci (triptofani) quando presenti, sia di opportune sonde fluorescenti legate in differenti siti proteici strategici che sono in grado di fornire informazioni sui cambiamenti conformazionali di struttura terziaria. Quando una proteina subisce questo tipo di cambiamenti può esporre al solvente residui idrofobici come i triptofani. Tale esposizione provoca una variazione dell’intorno dei residui ed una conseguente variazione del segnale emesso. E’ noto infatti che il quenching totale o parziale della fluorescenza del triptofano è correlabile all’aumento della polarità del suo intorno e quindi è molto spesso associata all’esposizione di questi fluorofori al solvente acquoso. Cambiamenti conformazionali della struttura della proteina possono, inoltre, dare luogo anche a significative variazioni nelle frequenze dello spettro di emissione. Le proprietà spettroscopiche dei triptofani possono essere sfruttate al meglio soprattutto nello studio di proteine come la BLG, che contiene solo due triptofani allocati in zone ben definite della proteina. Queste consente di attribuire le variazioni del segnale di emissione a cambiamenti nell’intorno di siti specifici.
In proteine che contengono più triptofani, come nel caso del lisozima, gli spettri di emissione dei triptofani forniscono un’ informazione “mediata” sul comportamento globale della proteina. In questi casi l’uso di opportune sonde fluorescenti permette di ottenere informazioni più dettagliate, in dipendenza dalle proprietà fisico-chimiche delle sonde stesse e della loro interazione con la proteina e con il solvente. Ad esempio, l’ anilino naftalene sulfonato (ANS), una piccola sonda fluorescente molto utilizzata in letteratura per studi sul folding ed unfolding delle proteine, verrà da noi utilizzata per studiare i cambiamenti conformazionali che coinvolgono le regioni idrofobiche eventualmente presenti nella proteina o che si formano durante il processo di aggregazione. Infatti, eventuali cambiamenti conformazionali di struttura terziaria della proteina possono portare all’esposizione al solvente o, al contrario, alla copertura della sonda, con conseguenti variazioni nell’intensità e nella posizione della sua emissione di fluorescenza. Lo studio dell’evoluzione degli spettri di emissione dell’ANS permette di seguire non solo l’apertura, anche parziale, della proteina, ma anche di osservare l’eventuale formazione di nuovi cluster idrofobici. L’ANS presenta inoltre il vantaggio di formare con le proteine legami non covalenti, senza quindi impegnare siti o residui specifici che potrebbero essere coinvolti in legami inter-molecolari durante il processo di aggregazione. Nel corso degli studi, se necessario, verranno selezionate altre sonde fluorescenti con caratteristiche fisico chimiche adatte all’analisi del processo in osservazione.

In regime di alte concentrazioni di proteina i cambiamenti conformazionali di struttura terziaria possono essere seguiti anche attraverso l'analisi degli spettri IR nella regione dell'Amide II (1540 cm-1). L’osservazione della cinetica del processo di “scambio H-D” che si riflette in una diminuzione della banda dell’Amide II ed in un corrispondente aumento del segnale dell’Amide II’ può fornire informazioni quantitative sull’apertura della struttura proteica e sull’esposizione al solvente delle regioni più interne.
I cambiamenti strutturali a livello di struttura secondaria invece verranno seguiti in campioni a bassa concentrazione attraverso la cinetica degli spettri CD (nella regione del lontano UV) e in campioni ad alta concentrazione attraverso l'analisi degli spettri IR nella regione dell'Amide I' (1650 cm-1). Parallelamente, l'utilizzo di tecniche di scattering di luce permetterà di seguire l'evoluzione delle dimensioni degli aggregati in soluzione.

La formazione di fibrille amiloidi sarà monitorata tramite la fluorescenza della Tioflavina T (TT). In presenza di fibrille amiloidi, la TT presenta un'intensa banda di fluorescenza i cui picchi di eccitazione e di emissione si trovano rispettivamente a ~450 e a ~482 nm. Tale banda risulta quasi del tutto assente in soluzione acquosa ed è scarsamente influenzata da aggregati proteici amorfi (non amiloidi). Inoltre, l'intensità di fluorescenza risulta essere con buona approssimazione direttamente proporzionale alla quantità di fibrille amiloidi presenti nel campione [Naiki et al., 1989,1999]. Tali proprietà fanno della TT un ottimo strumento per la rivelazione selettiva di aggregati amiloidi e per la determinazione dei tempi caratteristici dei processi di fibrillogenesi [Levine, 1999], anche se i meccanismi di interazione tra la sonda e le strutture amiloidi sono ancora poco chiari.

Infine, la caratterizzazione fisico-chimica delle strutture sopramolecolari formate verrà condotta con la microscopia a forza atomica (AFM). Quest'ultimo punto appare particolarmente rilevante, in quanto la presenza di ioni metallici potrebbe fortemente alterare la topologia degli aggregati ottenuti [Klug et al., 2003].

Verrà inoltre utilizzata la tecnica di calorimetria differenziale, che è in grado di fornire informazioni dirette sulle funzioni termodinamiche (entalpia, entropia, energia libera di Gibbs) che caratterizzano il processo di folding/unfolding delle proteine, sul pathway di unfolding, sui parametri cinetici nel caso di transizioni irreversibili (Freire et al, 1990; Sanchez-Ruiz 1992; Privalov, 1997; Kurganov et al., 1997). La conoscenza delle proprietà termodinamiche delle proteine e del numero di intermedi coinvolti nel pathway di unfolding è fondamentale per comprendere i principi di organizzazione e di stabilità della struttura tridimensionale delle macromolecole e dei loro aggregati. Infatti, la DSC è stata largamente utilizzata per lo studio della stabilità di proteine globulari a basso peso molecolare (Griko et al., 1994; Griko e Privalov, 1994; Radford e Dobson, 1995; Guzzi et al., 1999; Guzzi et al., 2003) e di proteine più complesse multimeriche e multidominio (Benitez-Cardoza et al., 2001; Thorolfsson et al., 2002) disperse in soluzioni acquose di diversa composizione e a valori controllati di pH e forza ionica.

Sul fronte dei metalli, la spettroscopia di assorbimento di raggi X(XAS) risulta particolarmente indicata per via della sua abilità nel risolvere la geometria locale dei siti metallici in proteine (o peptidi) e può essere utilizzata per studiare l’intorno di ioni metallici in complesso con proteine e peptici nel loro ambiente fisiologico. Con questa tecnica si possono avere direttamente informazioni sulla geometria intorno al metallo e identificare eventuali differenze strutturali modulate da differenti condizioni di soluzione (concentrazioni, pH, temperatura, ecc.), ed eventualmente riconoscere la presenza di siti di legame alternativi per ioni metallici diversi. La XAS sarà utilizzata in parallelo con altre tecniche sperimentali come la Spettrometria di massa con diversi metodi di ionizzazione e la Risonanza Magnetica Nucleare ad alta risoluzione.

Il progetto prevede anche l’utilizzo di tecniche numeriche da accoppiare alla XAS. In particolare, verrà effettueremo il trasporto su cluster di PC (a disposizione del gruppo) del codice Espresso (opEn-Source Package for Research in Electronic Structure, Simulation, and Optimization), già installato sul cluster Linux del CINECA. Con questo mezzo di calcolo ci proponiamo di calcolare la funzione densità elettronica di un modello del complesso Cu-(HGGGW)-H2O (il penta-peptide che rappresenta una frazione dell'octarepeat della proteina prionica di cui è stata risolta la struttura cristallografica in complesso con il Cu (32)) partendo con i nuclei localizzati nelle posizioni determinate dalla spettroscopia X. Studieremo in dettaglio la distribuzione elettronica di carica e la delocalizzazione degli elettroni tra Cu, istidina e azoti della catena laterale, con lo scopo di estrarre i parametri essenziali per un force-field classico effettivo e estendere a livello semi-empirico lo studio di peptidi più grandi con un numero diverso di ioni rame. Una volta verificatone l'efficacia, il metodo verrà esteso ai peptidi b-amiloidi. In questo caso il problema principale è quello di determinare la natura dell'interazione di metalli diversi, Zn e Cu in particolare, ai quali sono attribuiti in letteratura ruoli funzionali diversi.

Un’altra tecnica sperimentale che consente lo studio diretto delle proprietà degli ioni metallici in interazione con proteine è la spettroscopia di Risonanza Paramagnetica di Spin Elettronico (EPR). La spettroscopia EPR copre una ampia finestra temporale (dai nano ai millisecondi) e pertanto è una tecnica spettroscopica idonea per lo studio della dinamica conformazionale dei sistemi biologici (Berliner, 1976; Marsh and Horvath, 1989; Steinhoff, 2002). Nel caso in cui i biosistemi non posseggano un paramagnetismo intrinseco, l’applicazione dell’ESR è resa possibile mediante l’uso di spin-labels (Marsh, 1981). Spin-labels di diverso tipo, prodotti per sintesi, sono disponibili sul mercato. Alcuni di essi (p.es., iodoacetamide, maleimido, metanotiosulfonato) sono capaci di legarsi covalentemente, sotto opportune condizioni sperimentali, a residui ammino acidici specifici presenti nelle proteine quali, per esempio, cisteina, istidina e lisina. La dinamica degli spin-labels legati covalentemente riflette il moto della proteina insieme al moto residuo del label rispetto all’intera macromolecola (Steinhoff 1988; 2002). Usando questi spin-labels, tra gli altri aspetti, sono stati studiati con EPR i moti librazionali e le proprietà d’idratazione nell’emoglobina (Johnson 1978; Steinhoff 1989), la dinamica e la diffusione di piccole molecole sulla superficie proteica del lisozima (Steinhoff 1991; Artyukh et al. 1995), gli effetti del solvente sulle proprietà conformazionali dell’azurina (Guzzi e Sportelli, 1995), come pure gli effetti dell’idratazione sulle proprietà dinamiche dello “stratum corneum” (Alonso et al., 2003) e di batteri fotosintetici (Poluektov et al., 2003). In presenza di ioni metallici paramagnetici (come p.es. Cu2+), le misure EPR forniscono direttamente informazioni strutturali sul microambiente attorno al centro paramagnetico quali geometria/simmetria del sito di legame e natura degli atomi appartenenti alla prima sfera di coordinazione dello ione paramagnetico (Addison 1983; Pilbrow 1990).

Per la caratterizzazione della dinamica conformazionale dei due sistemi verrà utilizzata la spettroscopia EPR sia in onda continua (CW-EPR) che in regime pulsato (Fourier Transform EPR) con l’ausilio della tecnica dello spin labeling. Quali spin labels verrano utilizzati due radicali nitrossilici: lo Iodoacetamide (JAA) e il maleimido. Il lisozima verrà labellato con JAA che si lega covalentemente all’unico residuo di istidina (His) presente in posizione 15 nella catena polipeptidica principale. La His-15 è localizzata in prossimità della superficie proteica ed il label è pertanto in posizione ottimale per monitorare le proprietà molecolari all’interfaccia proteina/solvente. La BLG verrà labellata con lo spin label maleimido legato alla Cys-121.
Misure di CW-EPR saranno eseguite sulla proteine spin labellate sotto opportune condizioni di temperatura e di pH del mezzo di dispersione e in funzione della concentrazione proteica. Dalla variazione dell’anisotropia spettrale in funzione di questi parametri chimico-fisici potranno essere individuate le condizioni in cui avviene l’aggregazione proteica. Successive misure di EPR su proteine spin-labellate in presenza di differenti concentrazioni di ioni Cu2+ nel mezzo di dispersione consentiranno di monitorare contemporaneamente sia il segnale dei labels (g=2.0032) sia il segnale dovuto allo ione paramagnetico Cu2+ (g=2.054 - 2.2). In questo modo sarà possibile valutare sia l’effetto dello ione rame sull’aggregazione proteica che evidenziare la geometria del sito attivo attorno allo ione paramagnetico e la natura dei leganti.
Per valutare la cinetica di formazione degli stati aggregati, misure EPR saranno condotte anche in funzione del tempo su campioni proteici spin-labellati a concentrazioni fissate. Infatti, la variazione dell’anisotropia spettrale (posizione, intensità e larghezza delle righe di risonanza) conseguente alle interazioni di scambio di spin e dipolare è strettamente legata alle distanze tra i labels (2 - 25 Å) permettendo in tal modo di definire la distanza proteica intermolecolare (Voss et al., 1995; Lundberg et al., 1997; Serag et al., 2002).

Esperimenti di spin label CW-EPR in regime lineare permetteranno di studiare i moti su una scala temporale dai nano ai microsecondi, mentre misure di EPR non lineare in condizione di saturazione (ST-EPR) consentiranno di estendere l’indagine sulla dinamica rotazionale del sistema biologico fino ai millisecondi. Pertanto, questo approccio risulta particolarmente idoneo per investigare la dinamica rotazionale proteica in condizioni di aggregazione in cui, presumibilmente, la dinamica conformazionale sarà limitata dall’interazione proteina-proteina. Parallelamente, esperimenti in regime pulsato di FT-EPR a due e a tre impulsi di opportuna durata saranno effettuati nel dominio del tempo e in spazzata di campo magnetico. In particolare, misure di “Electron Spin Echo Envelope Modulation” (ESEEM) saranno eseguite con sequenze a due e tre impulsi di breve durata (hard pulses) in funzione del tempo. Il decadimento dell’eco risulta modulato per effetto dall’interazione dello spin dell’elettrone spaiato del nitrossido con i protoni vicini. L’analisi del segnale nel dominio delle frequenze fornirà informazioni sull’ambiente circostante il label e permetterà di valutare le proprietà dell’interfaccia proteina/solvente durante il processo d’aggregazione. Lo stesso approccio può essere applicato utilizzando come probe magnetico lo ione Cu2+, sebbene, a causa del rilassamento, gli esperimenti dovranno essere eseguiti alla temperatura di 4 K. Inoltre, nelle condizioni sperimentali di lavoro (X-band FT-EPR), la tecnica ESEEM è particolarmente sensibile alla debole interazione iperfine tra lo ione paramagnetico ed i nuclei quadrupolari, quali per esempio atomi di azoto appartenenti alla seconda sfera di coordinazione del metallo (Dikanov and Tsvetkov, 1992).

Dal decadimento dell’eco non modulato, ottenuto con impulsi di lunga durata (soft pulses), sarà misurato il tempo di rilassamento della memoria di fase, T2M, (2 impulsi) e il tempo di rilassamento longitudinale spin–reticolo, T1, (3 impulsi), parametri di notevole interesse per lo studio del comportamento dinamico dei sistemi proteine/solvente e proteina/proteina nello stato aggregato sia in assenza che in presenza dello ione Cu2+.

Infine, esperimenti d’integrazione dell’eco primario (ottenuto utilizzando 2 soft pulses) e dell’eco stimolato (ottenuto utilizzando una sequenza di 3 soft pulses) in funzione del campo magnetico (Echo-Detected spectra) permetteranno di studiare i moti librazionali di piccola ampiezza in un ampio range di scala temporale (dai nano ai microsecondi). Sarà possibile determinare l’ampiezza del moto librazionale e i tempi di correlazione rotazionale dello spin label legato alle matrici proteiche nelle varie fasi d’aggregazione.

The mechanisms by which metal ions affect protein aggregation processes are still poorly understood. Aim of the project is the study of such mechanisms by using several different experimental techniques, allowing to obtain information 1) on the local structures which may form around the metal ions during the aggregation process and 2) on the conformational changes and the aggregation of the proteins in the presence of metal ions. Therefore, aggregation processes will be studied by “looking” both at the metal and at the proteins. We hope in this way to highlight the effects of metal ions on the different phases of the aggregation process, i.e. 1) on the conformational changes leading the protein in a partially unfolded structure and 2) on the consequent aggregation. The flexibility of this project may allow to overcome the difficulties inherent to our ignorance on the nature of the interactions probably responsible for the onset of neuro-degenerative pathologies.

The flexibility of this project may allow to overcome the difficulties inherent in our ignorance of the nature of the metal-peptide interactions, helping in the difficult problem of understanding how metals can be possibly responsible for the instauration of these neuro-degenerative pathologies.

The most indicated proteins for these studies appear to be beta-lactoglobulin (BLG), Lysozyme and beta-amyloid (bA) peptide.

BLG and lysozyme are “small” globular proteins often used as model systems for the study of complex processes since, beyond their commercial availability, they have been extensively studied and their structural properties are very well known. Notwithstanding their stability, under suitable destabilizing conditions both proteins may undergo conformational changes at the level of tertiary and secondary structure, leading to the onset of aggregation processes.

BLG is one of the main constituents of bovine milk. Its association state depends on pH, in that the protein is dimeric at neutral pH and dimeric at acidic pH. The monomer is composed by 162 residues and its secondary structure is mainly constituted by beta structures (9 antiparallel beta-strands and 2 short alpha-elices). Two triptophans are present in the protein; the first (trp61) is located in an external region, completely exposed to the solvent, while the second is in the hydrophobic core of the protein. Moreover, BLG has five cysteine residues, four of which linked in two intra-molecular disulphide bridges. These residues are particularly important, due to the influence of disulphide exchange processes on the formation of supramolecular aggregates. It is well known that BLG may undergo aggregation and/or gelation processes. Such processes have been extensively studied because of their importance on food technology and, more recently, because under appropriate conditions the protein was found to form amyloid fibrils [Hamada & Dobson, 2002].

Lysozyme is a small enzyme (129 residues). Its secondary structure is composed by alpha-elices (45%), beta-sheets (19%) and beta-turns (23%). The protein presents four disulphide bridges and no free cysteines. Six triptophan residues are located in different region of the protein.
The typology of BLG and lysozyme aggregates strongly depends on the experimental conditions. In particular, in different external conditions both are able to form amorphous aggregates or amyloid fibrils [Hamada & Dobson, 2002, Booth, 1997, Shigeki Arai 1999], thus being a good model systems for studying the effects of metal ions on different kind of aggregation processes. Moreover, the influence of metal ions ones on the aggregation of BLG was yet partially documented [[K. Suzuki et al. 2001, G. E. Remondetto et al. 2003].

The bA peptide is a 39-43 residues polypeptide, arising from the proteolysis of the “Amyloid Precursor Protein” (APP). In its soluble form, it is a normal metabolic product present in the cerebrospinal fluid and in the serum. It is now commonly accepted that the formation of amyloid fibrils from this peptide has a key role in the Alzheimer disease. In vitro, the fibrillation process appears to be strongly affected by the presence of metal ions [Bush et al., 1994]. Moreover, large concentrations of metal ions have been found in the senile plaques typical of Alzheimer’s disease. In such a context, the study of the aggregation processes of bA peptide in the presence of metal ions has an intrinsic remarkable interest.

Concerning the general strategy of the project, since contradicting results are currently reported in the literature for similar metal-protein systems, we must put great care in the sample preparation and measurement protocols, and the experimental measurements will be made in strict sinergism between the three Reserach Units involved.
This means that we have to coordinate the three teams to work on “parallel samples” in such a way that the same sample is subjected to measurements with different experimental techniques.

In particular:
· The largest possible number of experimental data will be collected from different techniques (including XAS) on identical samples or on samples differing only by dilution factors.

· Taking advantage of the recently acquired capability of in situ peptides synthesis, small portions of amyloid peptides can be synthesized and studied. In this way different proteins or peptides in presence of different metals (e.g. amyloid-peptides in presence of Zn(II) or Cu(II) and PrP in presence of Mn (II) or Cu(II) or other metals) will be studied.

The study of the effects of metal ions on the aggregation processes of BLG, lysozyme and bA peptide will be performed by using several experimental techniques: Absorption Spectroscopy in infrared (IR) and UV-Visible ranges; steady-state fluorescence spectroscopy; circular dichroism (CD), static and dynamic light scattering; Atomic Force Microscopy (AFM). These techniques allow to study the aggregation processes in different space time scale and to explore different concentration regimes[M. Manno et al. 2004 P.L. San Biagio, et al. 1999,V. Militello et al. 2003, V. Militello et al. 2004, V.Vetri et al.2005].

The experimental approach will consist in kinetic studies of steady-state fluorescence of intrinsic chromophores (tryptophans), when they are present in the protein structure, and of some suitable fluorescent dyes bound to strategic sites of the proteins, thus allowing gaining information on tertiary structure conformational changes. This kind of conformational changes may promote the exposure to the solvent of hydrophobic residues like triptophans. Such exposure brings about a variation in the surroundings of the residues and therefore a variation on the fluorescence signal. It is well known indeed that the extent of the quenching of triptophan fluorescence depends on the polarity of its surroundings, thus being associated with the exposure of the residue to the aqueous solvent. Moreover, conformational changes may also bring about variations on the frequencies of the emission spectra. The spectroscopic properties of triptophans can be very well used to study proteins like BLG, which has only two triptophan residues in well defined regions of its structure. This allows assigning the variations in the emission signal to structural changes in specific regions of the protein. When several triptophans are present in the protein structure, as it is in the case of lysozyme, their emission spectra can only give an averaged information on the global behavior of the protein. In such cases, using suitable fluorescent dyes may give more detailed information, according to the physico-chemical properties of the dye and of its interactions with the protein and with the solvent. For instance, Aniline Naphtalene Sulphonate (ANS), a small dye widely employed in protein folding/unfolding studies, will be used to monitor the conformational changes involving hydrophobic regions of the protein or the formation of such regions during the aggregation process. Indeed, conformational changes at the level of tertiary structure may lead to the exposure or, on the contrary, to the burying of the dye, with consequent variations in the intensity and in the position of its fluorescence emission. The study of the kinetics of ANS emission spectra allows monitoring not only the aperture, even partial, of the protein, but also the eventual formation of hydrophobic clusters. Moreover, ANS does not form covalent bonds with the proteins, and therefore has the advantage of not sequestering specific sites which could be involved in intermolecular interactions during the aggregation process. During the project, if necessary, other dyes with suitable physico-chemical properties will be considered.

In the high concentration regimes, the conformational changes can be also followed through the IR spectra analysis in Amide II region (1540 cm-1). Monitoring the kinetics of the H-D exchange process, which is reflected by a decrease of the Amide II band and a corrisponding increase in the Amide II’ band, can give quantitative information on the aperture of the protein structure and on the solvent exposure of its inner regions.
Conformational changes at secondary structure level will be monitored by kinetic studies of far UV CD spectra in the low concentration regime and by the analysis of IR spectra in Amide I’ region (1650 cm-1) in the high concentration regime.
In parallel, by using light scattering techniques it will be possible to follow the evolution of the dimensions of the aggregates in solution.

The formation of amyloid fibrils will be monitored by means of Thioflavine T (TT) fluorescence. In fact, in the presence of amyloid fibrils, TT shows an intense fluorescence band, whose excitation and emission wavelengths are ~450 and ~482 nm respectively. Such band is vanishing in water solution and is poorly affected by amorphous (not amyloidal) aggregates. Moreover, the fluorescence intensity of TT appears to be, in a good approximation, linearly dependent on the amount of amyloid fibrils present in the sample [Naiki et al., 1989,1999 ]. These properties make TT a suitable tool for the selective detection of amyloid structures and for the determination of fibrillation characteristic times [Levine, 1999], even if the mechanisms of interaction between the amyloid structures and this probe are still unclear.

Finally, the physico-chemical characterization of the obtained supramolecular structures will be studied by atomic force microscopy (AFM). This last point appears to be of particularly important, since the presence of metal ions may strongly affect the topology of the obtained aggregates [Klug et al., 2003].

By using the DSC technique it is possible to get direct information on the thermodynamic functions (enthalpy, entropy and Gibbs free energy) that describe the folding/unfolding process of the proteins, on the unfolding pathway, on the kinetic parameters when the transitions are irreversible (Freire et al, 1990; Sanchez-Ruiz, 1992; Privalov, 1997; Kurganov et al., 1997). The knowledge of the thermodynamic properties of the proteins is important for a complete understanding of the principles of organization and stability of the three-dimensional structure of the macromolecules. This technique has widely been used to study the stability of globular proteins with low molecular weight (Griko et al., 1994; Griko and Privalov, 1994; Radford and Dobson, 1995; Guzzi et al., 1999; Guzzi et al., 2003) as well as of more complex proteins with a multimeric and multidomain organization (Benitez-Cardoza et al., 2001; Thorolfsson et al., 2002) dissolved in aqueous solution with different composition at controlled pH and ionic strength.

Concerning the metal ions, X-ray Absorption Spectroscopy (XAS) results to be particularly well suited, due to its ability to resolve the local geometry of the metallic site in proteins (or peptides) and can be profitably used to study the environment of metal ions complexed with proteins and peptides in their physiological environment. With this technique one can directly have information on the geometrical arrangement of the metal and determine the structure adopted by the complex under different biological conditions (concentration, pH, temperature, etc.). In many cases it allows the identification of possibly different binding sites associated to different metal ions. XAS will be employed in parallel with other experimental techniques such as high resolution Mass Spectrometry with various ionisation methods and high resolution Nuclear Magnetic Resonance.

Numerical techniques will be coupled to XAS spectroscopy. We will port the so-called Espresso (opEn-Source Package for Research in Electronic Structure, Simulation, and Optimization) code, already installed on the CINECA Linux cluster, on the PC cluster available to our group. The actual computation that will be performed in this project consists in the evaluation of the electronic density functional of a model for the Cu-(HGGGW)-H2O complex, where HGGGW is the relevant oligopeptide subunit of the octa-repeat sequences of Prion Protein. The structure of the latter has been recently resolved by X-ray chrystallography (32). By starting with the configuration in which nuclei are located at the positions determined by X-ray spectroscopy, the electronic charge distribution and delocalization among Cu, His and the backbone amide atoms will be studied in details, with the aim of extracting the essential parameters of an effective classical force-field and to extend at a semi-empirical level the study to larger peptides with variable number of copper ions. If successful, the method will be also extended to larger systems like the b-amyloid peptide complexes. In this case it is of the utmost importance to clarify the nature of the structural role of the different metals (especially Zn and Cu).

Another experimental techninque that allows to directly the properties of metal ions in interaction with the proteins is Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy (EPR).

EPR spectroscopy covers a wide time window (from nano- to microseconds) and, therefore, is a suitable spectroscopic technique for the investigation of the conformational dynamics in the biological systems (Berliner, 1976; Marsh and Horvath, 1989; Steinhoff, 2002). When the biosystems are not paramagnetic, the application of ESR is possible by using spin-labels (Marsh, 1981). Different spin-labels have been synthesized and are available on the market. Some of them (i.e., maleimide, iodoacetamide, methanethiosulfonate), under appropriate experimental conditions, covalently bind to specific amino acids that are present in the proteins such as cysteine, histidine and lysine.
The dynamics of the covalently-bound spin-labels reflects the motion of the macromolecule or some residual motion of the label with respect to the whole macromolecule (Steinhoff, 1988; 2002). Using these spin-labels, several aspects have been studied by EPR spectroscopy, including the librational motions and the hydration properties of hemoglobin (Johnson 1978; Steinhoff 1989), the dynamics and the diffusion of small molecules on the surface of lysozyme (Steinhoff, 1991; Artyukh et al., 1995), the solvent effects on the conformational properties of azurin (Guzzi and Sportelli, 1995), as well as the hydration effects on the dynamic properties of the stratum corneum (Alonso et al., 2003) and of the photosynthetic bacterial reaction center (Poluektov et al., 2003). In the presence of paramagnetic metal ions (such as Cu2+), the EPR experiments directly give structural information on the microenvironment around the paramagnetic centre, the symmetry of the active site and the chemical nature of the ligand atoms of the first coordination sphere of the ion (Addison 1983; Pilbrow 1990).

The technique employed for the characterisation of the conformational dynamics of the systems is EPR spectroscopy, both in continuous wave and in the pulsed regime, by using the spin-labeling method. The spin-labels that will be used are two nitroxide radicals: iodoacetamide (JAA) and maleimido. Lysozyme will be labeled with JAA, which covalently binds to the unique histidine residue at the position 15 along the polypeptide chain. His-15 is located close to the protein surface, therefore the label will monitor the molecular properties of the protein/solvent interface. Beta-lactoglobulin will be labeled with maleimido, which covalently binds to Cys-121.
Continuous wave-EPR measurements will be performed on the spin-labelled proteins as a function of protein concentration under appropriate conditions of temperature and pH of the dispersion medium. From the variation of the spectral anisotropy as a function of the above mentioned chemical-physics parameters, the conditions under which protein aggregation occurs can be determined. Further CW-ESR measures on spin-labelled proteins in the presence of increasing concentration of copper ions in solution will allow us to simultaneously monitor both the signal of the label (around g=2.0023) and the signal due to the Cu2+ ion (around g =2.054 - 2.2). In such a way, it will be possible to evaluate the effects of the copper ions on the protein aggregation and to evidence the geometry of the active site around the paramagnetic ions as well as the nature of the ligands.
In order to follow the kinetics of formation of the aggregated states, CW-EPR measures will also be carried out as a function of time on spin-labelled proteins at fixed concentration. Indeed, the variation of the spectral anisotropy (position, intensity and width of the resonance lines), due to the dipolar and exchange spin-spin interactions, is closely related to the distance between the labels (2 - 25 Å), thus allowing to define the intermolecular protein distance (Voss et al., 1995; Lundberg et al., 1997; Serag et al., 2002).
While experiments of spin-label EPR in continuous wave and linear regime allow to point out rotational motions of the macromolecules from nano- to microseconds, non-linear EPR measurements under saturation conditions (ST-EPR) will allow to extend the investigation to the rotational dynamics up to milliseconds. Therefore, this approach is particularly useful to study protein rotational dynamics in molecular aggregation conditions in which a restriction of the conformational dynamics due to the protein-protein interactions is expected.
Correspondingly, EPR experiments in the pulsed regime using sequences of two and three pulses of suitable time length will be performed in the time domain as well as sweeping the magnetic field. In particular, measurements of Electron Spin Echo Envelope Modulation (ESEEM) will be performed with two and three-pulse sequences of short time length (hard pulses) as a function of time. Echo decay is modulated as a consequence of the interaction between the spin of the unpaired electron of nitroxide and the nearby protons. The analysis of the signal in the frequency domain will allow to get information on the environment around the label, and to estimate the properties of the protein/solvent interface in the aggregation process. The same approach can be applied by using as probe the paramagnetic ion Cu2+, although, due to relaxation effects, the experiments will be performed at the temperature of 4 K. Moreover, under the experimental condition (X-band FT-EPR), the ESEEM technique is particularly sensitive to the weak hyperfine interaction between the paramagnetic ions and the quadrupolar nuclei, such as the remote nitrogen atoms (Dikanov and Tsvetkov, 1992). From the un-modulated echo decay, obtained with pulses of long time length, the phase-memory (T2M, two pulse experiments) and longitudinal spin-lattice (T1, three pulse experiments) relaxation times will be measured. Both parameters are of great interest in the study of the dynamic behaviour of protein/solvent and protein/protein in the aggregated state, both in the absence and in the presence of copper ions.
Finally, experiments performed by integrating the primary echo (obtained using two soft pulses) and the stimulated echo (obtained using a sequence of three soft pulses) sweeping the magnetic field (Echo-Detected spectra) will allow to study small-amplitude librational motions in a wide range of time scales. It will be possible to determine the amplitude of librational motion and the rotational correlation time of the spin-labels bound to the protein matrices in the different steps of the aggregation process.

LEONE (Cognome)	MAURIZIO (Nome)
Professore Straordinario (Qualifica)	02/10/1952 (Data di nascita)	LNEMRZ52R02G273U (Codice di identificazione personale)
FIS/07 - Fisica applicata (a beni culturali, ambientali, biologia e medicina) (Settore scientifico-disciplinare)
Università degli Studi di PALERMO (Università)
Facoltà di SCIENZE MATEMATICHE FISICHE e NATURALI (Facoltà)
Dipartimento di SCIENZE FISICHE ED ASTRONOMICHE (Dipartimento)
091/6234216 (Prefisso e telefono)	091/6162461 (Numero fax)	leone@fisicaechimica.unipa.it (Indirizzo posta elettronica)